Las placas ELISA se utilizan habitualmente en análisis y ensayos sanitarios para la detección de antígenos en muestras mediante espectrofotometría
Los lectores de microplacas o espectrofotómetros ELISA se calibran y verifican con microplacas. Así, con las placas ELISA -también denominadas placas patrón o microplacas- es posible hacer la calibración de la escala de longitud de onda y de la escala fotométrica del equipo.
En esta entrada hablamos sobre las placas ELISA, así como sobre la técnica que les da nombre, sus usos y algunos ejemplos de la reglamentación y normativa que hace referencia a esta técnica y a la utilización de las microplacas.
Técnica ELISA
Se denomina técnica ELISA al ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas. El término proviene del acrónimo en inglés, Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay.
Mediante espectrofotometría, esta técnica permite la detección de un antígeno a través de un anticuerpo enlazado a una enzima. Para ello, habitualmente, se hace uso de algún producto detectable, como puede ser el cambio de color, que posibilitaría la medición del antígeno. Es decir, una reacción inmunoenzimática con adición de sustrato y determinación cuantitativa colorimétrica.
Instrumentos de medida
Microplacas ELISA
Las microplacas o placas patrón se utilizan para la verificación o calibración interna de los lectores de microplacas o espectrofotómetros ELISA.
Estas placas suelen tener forma rectangular y dimensiones aproximadas de 12.5 cm por 8.5 cm. Otra característica de las microplacas es que contienen 96 pocillos, distribuidos en 8 filas por 12 columnas. En concreto, cada una de las columnas representa un valor de absorbancia concreto a diferentes longitudes de onda. Además, en ocasiones, existen placas con columnas que se utilizan para la calibración de la escala de longitud de onda; éstas contienen un filtro de óxido de holmio con picos de absorbancia conocidos.
Mediante el uso de estas placas patrón, los espectrofotómetros ELISA o lectores de microplacas pueden calibrarse en absorbancia o en longitud de onda.
Por lo que respecta a la calibración en absorbancia, o calibración de la escala fotométrica, permite medir la exactitud o la corrección que presenta el equipo respecto a los valores de absorbancia para diferentes longitudes de onda. Estas placas contienen 5 o 6 filtros de densidad neutra con distintos valores de absorción (desde 0.2DO hasta 3.5DO) dispuestos a lo largo de las columnas.
Por su parte, con algunos modelos de microplacas también puede realizarse la calibración de la escala de longitud de onda. Se trata de microplacas que en sus columnas contienen filtros, habitualmente de óxido de holmio, con bandas de absorción estrechas para diferentes longitudes de onda. Estos filtros presentan picos de absorbancia desde 240nm a 650nm en el rango del UV-Visible. Así, mediante esta calibración puede evaluarse la capacidad del componente monocromador del espectrofotómetro para separar una longitud de onda concreta del resto del espectro de iluminación.
Espectrofotómetros ELISA, lectores de microplacas
Los espectrofotómetros ELISA o lectores de microplacas son equipos ópticos que, como los espectrofotómetros UV-Visible, miden la cantidad de luz que transmite o absorbe una muestra para diferentes longitudes de onda.
Este tipo de instrumentos están compuestos por una fuente de iluminación, un monocromador y un detector.
En cuanto al sistema de iluminación, cabe decir que los lectores de microplacas suelen trabajar en un rango que va desde los 400nm a los 700nm. Es frecuente que dispongan de una fuente de tungsteno para la zona visible, aunque existen también equipos que llegan al rango ultravioleta.
Por lo que respecta al monocromador, permite separar el espectro de iluminación y proporcionar un haz de energía a una longitud de onda determinada. Cuando la longitud de onda es crítica o afecta a las medidas que se realizan, ha de realizarse una calibración de este componente, es decir, una calibración en longitud de onda. Es posible calibrar diferentes puntos de longitud de onda en todo el rango del equipo.
Finalmente, el detector transforma la señal que recibe (fotones) y la convierte en señal eléctrica. La intensidad de la señal eléctrica se registra mediante un sistema que proporciona valores de absorbancia o densidad óptica.
Usos y reglamentación
Usos de la técnica ELISA
La amplia variedad de ensayos y análisis que pueden llevarse a cabo con esta técnica hace entender la diversidad de normas y reglamentos en los que se indica la conveniencia de la utilización de métodos y procedimientos que hacen uso de la misma.
Por poner algunos ejemplos, la técnica ELISA se utiliza para el diagnóstico de enfermedades como el cáncer, el Alzheimer, la hepatitis B, presencia del VIH o del COVID-19. Así, mediante esta técnica pueden realizarse, por ejemplo, pruebas para la detección de la proteína TAU; la proteína P-TAU; la proteína β-amiloide 1, 42; o el análisis de la presencia de anticuerpos IgM e IgG frente al virus SAR-CoV-2.
Por su parte, en el campo de la medicina veterinaria es posible detectar anticuerpos, por ejemplo, frente a la lengua azul, la Brucella, la leucosis enzoótica bovina, la peste porcina, la glicoproteína gE de la enfermedad de Aujeszky o de la proteína priónica patógena de las encefalopatías espongiformes transmisibles.
Además, la técnica ELISA también es utilizada para la detección de alérgenos en alimentos de uso humano o animal. La cuantificación de gluten, huevo, β-lactoglobulina, soja, cacahuete o almendra, entre otros, son ejemplos de su uso en este campo.
Ejemplos de reglamentación
Como hemos explicado arriba, son variadas las normas y reglamentos que explicitan métodos para la detección de antígenos, protocolos para la normalización de materiales y procedimientos de análisis mediante esta técnica. Es el caso del Reglamento (UE) Nº206/2010 de la Comisión. En este reglamento se establecen listas de terceros países, territorios o bien partes de terceros países o territorios autorizados a introducir en la Unión Europea determinados animales o carne fresca y los requisitos de certificación veterinaria. En este sentido, este reglamento indica el uso de la técnica ELISA, por ejemplo, en procedimientos de análisis para la fiebre catarral ovina (FCO) o para la fiebre aftosa (FA), entre otros.
Otro reglamento que explicita el uso de placas ELISA es, por ejemplo, el Reglamento (UE) Nº 1064/2012 de la Comisión. Éste indica que para realizar pruebas de diagnóstico rápido se puede emplear inmunoanálisis basado en una microplaca ELISA para la detección de PrPRes resistente a la proteinasa K con anticuerpos monoclonales (Prionics-Check LIA test) para el seguimiento de la EEB en bovinos.
Además de legislación o reglamentos, existen normas que establecen métodos de ensayo para la detección de determinados antígenos. Por poner algún ejemplo, la norma UNE-EN ISO 19020:2008 establece un método horizontal para la detección inmunoenzimática de enterotoxina estafilocócica en los productos alimenticios.
Otro ejemplo para el caso de la detección de alérgenos mediante inmunoensayos (ELISA) es la Norma UNE-EN 15633-1:2009, que tal y como indica AENOR, «proporciona el esquema general de los métodos cualitativos y cuantitativos dirigidos a la determinación de alérgenos y de ingredientes alergénicos en los productos alimenticios. Para ello se utilizan métodos basados en anticuerpos, especificando las directrices generales y los criterios de funcionamiento dirigidos a la detección y cuantificación de proteínas que sirven como marcadores de la presencia de alimentos o de ingredientes alimentarios causantes de reacciones alérgicas.»
Laboratorios Eyco
Laboratorios Eyco dispone de acreditación ENAC para la calibración de filtros de longitud de onda y filtros de densidad neutra.
A continuación se muestra el alcance técnico de Laboratorios Eyco para la calibración de microplacas.
